Protocadherine-1 expressie in het luchtwegepitheel: onderzoek naar een nieuwe oorzaak van luchtwegov

  • Naam promovendus: prof Dr G.H. Koppelman
  • Instituut Universiteit: UMCG

Dit onderzoek kan bijdragen tot een beter inzicht in de functie van PCDH1, een nieuw gen voor luchtwegovergevoeligheid en astma. Als onze hypothese over de rol van verschillende PCDH1 isovormen bij astma juist blijkt te zijn, zal de volgende stap zijn om te onderzoeken of we dit experimenteel kunnen veranderen. Dit is dan een eerste opzet kunnen zijn tot een nieuwe therapeutische benadering voor astma.

Astma is een veel voorkomende chronische ontstekingsziekte van de luchtwegen; wereldwijd hebben meer dan 300 miljoen kinderen en volwassenen deze ziekte. Astma wordt gekenmerkt door klachten van de luchtwegen zoals hoesten, piepende ademhaling en benauwdheid. Dit hangt samen met een wisselend optredende vernauwing van de luchtwegen en luchtwegovergevoeligheid: het verschijnsel dat de luchtwegen zich vernauwen op prikkels zoals kou, rook of mist.
Luchtwegovergevoeligheid wordt deels door de erfelijke aanleg bepaald en is een risicofactor voor de ontwikkeling van astma. In het verleden ontdekten we dat erfelijke factoren op het vijfde chromosoom samenhangen met luchtwegovergevoeligheid en astma, en recent toonden we aan dat het gen dat codeert voor Protocadherine 1 (PCDH1) hiervoor verwantwoordelijk is. PCDH1 werd ontdekt door koppelingsanalyse in Nederlandse families die zijn onderzocht omdat er een vader of moeder met astma in voorkomt. Daarna werd in 7 onderzoekspopulaties in Nederland, Engeland en de Verenigde Staten de rol voor dit gen bij het ontstaan van luchtwegovergevoeligheid bevestigd.
PCDH1 codeert voor een adhesiemolecuul, een eiwit dat er voor zorgt dat cellen aan elkaar hechten. Het eiwit PCDH1 komt voor in het epitheel van de luchtwegen, dit zijn de cellen die de luchtwegwand bekleden. Omdat het epitheel de eerste barrière is tegen inhalatie van schadelijke stoffen, is het erg belangrijk dat het epitheel goed hecht. Recent ontdekten we dat er verschillende vormen van PCDH1 bestaan, zogenaamde PCDH1 isovormen. Er zijn langere en kortere vormen, waarbij er belangrijke verschillen voorkomen in het stuk van PCDH1 dat gebruikt zou kunnen worden om signalen in de cel af te geven.
De centrale hypothese van dit onderzoek is dat PCDH1 bijdraagt aan de integriteit van het luchtwegepitheel, en dat een verandering in het PCDH1 gen leidt tot luchtwegovergevoeligheid en astma. Deze genetische veranderingen leiden dan tot de expressie van andere PCDH1 isovormen, die op hun beurt weer leiden tot een verandering in signalering van PCDH1 in de cel.
Dit onderzoeksproject wordt uitgevoerd door PCDH1 expressie van mRNA en eiwit vast te stellen in gekweekt luchtwegepitheel van astmapatiënten en gezonde controles, als ook PCDH1 isovormen aan te kleuren in biopsi?n van de luchtwegwand van astmapatiënten. In dit onderzoek kunnen we zo een relatie leggen tussen PCDH1 gen-varianten, de PCHD1 isovorm expressie in de luchtwegen, en de ontsteking en remodelering van de luchtwegen.
Ten tweede zullen we de rol van de PCDH1 isoformen in luchtwegepitheel cellijnen onderzoeken, allereerst door de isovormen selectief uit te schakelen, daarnaast door ze tot overexpressie te brengen. Het effect op cel-cel contacten en de proliferatie van cellen zal worden vastgesteld.
Ten derde zal in dit onderzoek de signalering van PCDH1 in de cel worden onderzocht, door te onderzoeken of bepaalde eiwitten hechten aan PCDH1 en door nieuwe eiwitten, die aan PCDH1 hechten, te identificeren.
Samengevat zal dit onderzoek kunnen bijdragen tot een beter inzicht in de functie van PCDH1, een nieuw gen voor luchtwegovergevoeligheid en astma. Als onze hypothese over de rol van verschillende PCDH1 isovormen bij astma juist blijkt te zijn, zal de volgende stap zijn om te onderzoeken of we dit experimenteel kunnen veranderen. Dit is dan een eerste opzet kunnen zijn tot een nieuwe therapeutische benadering voor astma.

Abstract

Asthma is a chronic inflammatory airway disease affecting over 300 million of individuals worldwide. It is characterized by respiratory symptoms, variable airway obstruction, and bronchial hyperresponsiveness (BHR). BHR has a considerable genetic component and constitutes a risk factor for asthma development.
We initially reported linkage of BHR to chromosome 5q31-q33 in Dutch asthma families. In this chromosomal region, we have identified protocadherin-1 (PCDH1) as a novel gene for BHR and asthma (Koppelman et al, in revision) using linkage analysis and fine mapping in Dutch asthma families, and replication studies in 7 populations from the Netherlands, USA and UK. Three PCDH1 variants were associated with BHR and asthma.
PCDH1 encodes an adhesion molecule that is expressed in differentiated airway epithelial cells. Since airway epithelium constitutes the first barrier against inhaled toxic and allergic substances, it is important that this epithelial barrier is intact and relevant to study PCDH1 function. We recently identified novel PCDH1 mRNA isoforms in airway epithelium of asthmatics. Important differences between these isoforms are found in the intracellular domains of PCDH1, potentially resulting in changes in signalling properties.

The central hypothesis of this research project is that PCDH1 plays a role in epithelial integrity of the airways and that an altered function of PCDH1 is associated with BHR development, which may lead to symptomatic asthma. Firstly, we hypothesize that PCDH1 gene variants that are associated with BHR and asthma result in altered PCDH1 isoform expression. Secondly, these differences in PCDH1 isoform expression lead to an altered PCDH1 (signalling) activity that contributes to the sensitivity of airway epithelial cells to injury in asthma. This hypothesis will be tested in epithelial cell lines, epithelial cells obtained by airway brushings, and airway wall tissue of asthmatics and healthy controls.

The aim of the current proposal is
1. To investigate the functional role of PCDH1 gene variants associated with BHR in PCDH1 isoform expression. We will investigate PCDH1 mRNA expression in primary epithelial cell cultures of 25 asthmatics using quantitative PCR, as well PCDH1 protein using Western blotting. To this aim, we recently validated PCDH1 isoform specific antibodies. Moreover, we will perform immunohistochemistry using PCDH1 isoform specific antibodies in asthmatics and healthy controls. Thus, we will be able to investigate the association between PCDH1 gene variants, PCDH1 isoform expression and markers of airway inflammation and remodelling in asthma.
2. To investigate the role of PCDH1 isoforms in cell-cell adhesion and cell proliferation by two complementary approaches: Downregulating specific PCDH1 isoforms by siRNA in 16HBE and airway epithelial cell cultures and overexpression of specific PCDH1 isoforms in the airway epithelial cell line BEAS2B. To investigate cell-cell contacts, we will use Electric Cell–Substrate Impedance Sensing (ECIS), a tool to monitor the formation of cell-cell and cell-matrix contacts. The role of PCDH1 isoforms in epithelial cell proliferation will be investigated by BRDU incorporation.
3. To investigate intracellular signal transduction of PCDH1 in airway epithelium using co-immunoprecipitation and pull down assays. We will investigate proposed PCDH1 interaction partners from the literature, and perform an unbiased approach to identify novel interaction partners.

  • Bedrag:
    232.282,00
  • Looptijd:
    4 jaar,
  • Soort subsidie:
    Research Project
  • Andere aanvragers/partners:
    Dr M.C. Nawijn
    prof D.S. Postma
  • Projectnummer:
    3.2.09.055