Regocnition and cytokne signalling pathways in the host defence against Aspergillus fumigatus

  • Naam promovendus: Drs M.S. Gresnigt
  • Instituut Universiteit: Mark Gresnigt
  • Datum van promotie: 29-05-2015
  • Afgesloten

Het immuunsysteem speelt een fundamentele rol tijdens infecties met de schimmel Aspergillus fumigatus, en heeft zowel heilzame als nadelige gevolgen voor de gastheer. Patiënten met een gecompromitteerde immuun status zijn gevoelig voor het ontwikkelen van aspergillose, en individuen die een overgevoelige afweerrespons tegen Aspergillus opwekken lopen risico om een allergische aspergillose te ontwikkelen. Het efficiënt opruimen van ingeademde schimmelsporen door het immuunsysteem is cruciaal voor het voorkomen van uitgroei van schimmels in de longen. In dit proefschrift worden verschillende studies beschreven die nieuw licht werpen op hoe het immuunsysteem de schimmel A. fumigatus herkent en welke cytokine netwerken een rol spelen in de afweer tegen A. fumigatus.

De herkenning van pathogeen specifiek moleculaire patronen (PAMPs) door gespecialiseerde pathogeen herkenningsreceptoren (PRRs) op afweercellen, is de eerste stap in de afweer tegen een binnengedrongen pathogeen. Herkenning van PAMPs op de celwand van Aspergillus is cruciaal voor het activeren van afweermechanismen. In hoofdstuk 2 wordt een overzicht gepresenteerd van de huidige kennis op het gebied van herkenning van Aspergillus door het immuunsysteem en wordt beschreven hoe de gespecialiseerde PRRs specifieke afweermechanismen activeren. We constateren dat haast alle bekende PRRs, behalve RIG-I helicase, een rol spelen in de herkenning van PAMPs op de celwand van A. fumigatus. Daarnaast wordt een overzicht gegeven van de wijze waarop deze immuunreceptoren specifieke afweermechanismen zoals: fagocytose, cytokine signalen en de adaptieve afweerrespons activeren. Alhoewel in het overzicht de brede kennis op het gebied van herkenning van Aspergillus in de afweerreactie wordt beschreven is het onbekend welke moleculaire patronen op de celwand van Aspergillus herkend worden, en bij veel immuunreceptoren is het onbekend hoe zij de antischimmel afweerreactie in gang zetten.
Fagocytose is één van de belangrijkste mechanismen die door PRRs gereguleerd wordt. In individuen met een goed functionerend immuunsysteem ruimen de fagocyterende immuuncellen de ingeademde schimmelsporen efficiënt op. Tot op heden is weinig bekend over de regulerende mechanismen in afweercellen die de gefagocyteerde Aspergillus sporen doden. In hoofdstuk 3 wordt beschreven dat het ontkiemen (opzwellen) van Aspergillus sporen in monocyten resulteert in een selectieve inductie van autofagie. Het opzwellen van sporen leidt tot blootstelling van PAMPs, zoals ß-1,3-glucan 2, die door de PRRs op afweercellen 1 herkend kunnen worden. We vonden dat de vorming van LC3 positieve (auto)fagosomen, met daarin ontkiemende A. fumigatus sporen, gereguleerd worden door de oppervlakte expressie van ß-glucan. Dectine-1 is de receptor op monocyten die ß-glucan herkent, en van deze receptor is eerder beschreven dat deze cruciaal is voor een doeltreffende afweer tegen schimmels 3-8. Met behulp van specifieke dectine-1 remmers en cellen van patiënten, die deficiënt zijn voor dectine-1, hebben we aangetoond dat herkenning van ß-glucan door dectine-1 van fagocytose met associatie van LC3 reguleert. Immunosuppressieve behandeling met hoge doseringen van corticosteroïden is een belangrijke risicofactor voor de ontwikkeling van aspergillose 9. In dit hoofdstuk hebben we aangetoond dat corticosteroïden interfereren met LC3 geassocieerde fagocytose van Aspergillus door selectief de herkenning van ß-glucan door dectine-1 te remmen. Men zou daarom kunnen aannemen dat corticosteroïden bijdragen aan de gevoeligheid voor aspergillose doordat de LC3 fagocytose, die nodig is voor het opruimen van Aspergillus, specifiek door corticosteroïden worden geremd.

Hoewel PRRs aanvankelijk cel activatie en cel-cel communicatie door middel van cytokines in het aangeboren immuunsysteem reguleren, zorgen zij er indirect voor dat er een cytokine milieu gecreëerd wordt dat de inductie van adaptieve immuunrespons reguleert. Er is nog weinig bekend over de adaptieve T-helper immuunrespons tegen Aspergillus in mensen, en in het bijzonder de Interleukine(IL)-22 respons door T-helper cellen. Deze IL-22 respons is recentelijk onder de aandacht gekomen doordat verschillende studies hebben aangetoond dat deze cytokine respons belangrijk is voor de bescherming van de gastheer tegen invasieve aspergillose 6. Deze cytokine kan echter een schadelijke rol spelen in allergische aspergillose 10. In hoofdstuk 4 hebben we onderzocht hoe PRRs en verschillende cytokines van het aangeboren immuunsysteem de inductie van de T-helper respons tegen Aspergillus reguleren. We vonden enerzijds dat inductie van de T-helper cytokines IL-17 en IL-22 geremd werd door blokkade van Toll-like receptor (TLR)4 en complement receptor (CR)3, terwijl anderzijds blokkade van TLR2 deze reacties versterkte. De inductie van de T-helper cytokine Interferon(IFN)? werd alleen beïnvloed door blokkade van complement receptor 3. In tegenstelling tot eerdere studies die uitgevoerd zijn in muizen 3,6,10, vonden we met behulp van dectine-1 blokkade, dat dectine-1 slechts een beperkte rol speelt in de humane T-helper response geïnduceerd door Aspergillus. We konden deze bevinding bevestigen met cellen afkomstig van dectine-1 deficiënte patiënten. Naast de regulatie van de T helper respons door pathogeen herkenningsreceptoren hebben we aangetoond dat de IL-17, IL-22 en IFN? respons op Aspergillus uitsluitend T-cel afhankelijk is. Vervolgens hebben we de T-cel subsets die deze cytokines produceren verder gekarakteriseerd. We vonden in het bijzonder dat de productie van de cytokine IL-22 niet beperkt is tot een specifieke T-helper subset, maar geproduceerd kan worden door T-cellen die ook IL-17 en IFN? tot expressie brengen. De subset T-cellen die uitsluitend IL-22 produceren hebben we verder gekarakteriseerd, en we vonden dat deze cellen naast IL-22 ook tumour necrose factor(TNF)a tot expressie brengen, een kenmerk van de recent beschreven Th22 subset 11. Verder hebben we aangetoond dat de inductie van deze subgroep afhankelijk is van zowel IL-1 en TNFa . Deze data wijzen op een rol voor de recentelijk beschreven Th22 cellen in de afweer tegen Aspergillus, wat interessant is om verder te onderzoeken door de eerder beschreven gunstige effecten van IL-22 in invasieve aspergillose 6 en de nadelige effecten in allergische aspergillose 10.

Patiënten met ernstige vormen van astma hebben vaak positief testresultaat tegen allergenen afkomstig van schimmels. De allergische reactie wordt in deze patiënten gedreven door de T-helper 2 respons, die ook een belangrijke rol speelt in de progressie van overgevoeligheid voor schimmelallergenen als ziektebeeld van allergische bronchopulmonale aspergillose (ABPA) 12,13. Daarnaast is de Th2 respons in staat om de protectieve Th1 response tegen Aspergillus te onderdrukken 14,15, waardoor het uitgroeien van Aspergillus sporen minder goed onderdrukt wordt, hetgeen uiteindelijk leidt tot een verhoogde schade in de longen en een hogere mortaliteit. In hoofdstuk 5 hebben we onderzocht welke PRRs de inductie van de Th2 respons door Aspergillus reguleren. We vonden dat uitsluitend de sporen van Aspergillus een allergische Th2 respons opwekken, terwijl hyfen van Aspergillus en andere pathogenen de Th2 respons niet sterk induceren. Zoals in het vorige hoofdstuk beschreven vonden we dat CR3 wederom een belangrijke rol speelt in de inductie van de Th2 response door Aspergillus. We constateerden dat de receptoren TLR2, TLR4 en dectine-1 geen rol speelden in de inductie van de Th2 respons door Aspergillus. Een interessante observatie in deze studie was dat cellen van ABPA patiënten een verhoogde Th2/Th1 ratio hebben, wanneer de respons wordt vergeleken met niet allergische individuen. In de wetenschap wordt er van uitgegaan dat een verstoorde Th2/Th1 ratio ten grondslag ligt aan de schadelijke immunopathologie in ABPA. Derhalve hebben we geprobeerd de verstoorde Th2/Th1 ratio met immunomodulatoire medicijnen te herstellen. Neutralisatie van IL-1 door anakinra (recombinant IL-1 receptor antagonist) of TNFa door etanercept (recombinant TNFa receptor II) resulteerde in een verlaging van de Th2 respons op Aspergillus, maar neutraliseerde ook de inductie van de Th1 respons. Recombinant IFN? (immukine) werd gebruikt om de Th2 respons te neutraliseren en interfereerde daarbij niet met de Th1 respons. Deze observaties laten zien dat behandeling met recombinant IFN? een mogelijke immunomodulatoire therapie is voor ABPA door het remmen van de Th2 as en het ondersteunen van de Th1 respons tegen Aspergillus.

De NACHT-LRR receptoren (NLRs) NOD1 en NOD2 zijn intracellulaire PRRs die een cruciale rol spelen in de herkenning van bacterieel peptidoglycaan door cellen van het aangeboren immuunsysteem 16-22. Tegen verwachting in is er bewijs dat de NOD2 receptor mogelijk een rol speelt in de afweer tegen A. fumigatus 21,22. In hoofdstuk 6 hebben we de rol van NOD1 en NOD2 onderzocht in de afweer tegen Aspergillus en de gevoeligheid voor het ontwikkelen van aspergillose. Door cellen te gebruiken van patiënten met de ziekte van Crohn, bij wie de NOD2 receptor niet functioneel is, hebben we aangetoond dat NOD2 nodig is voor het opwekken van een immuun respons tegen Aspergillus door zowel het aangeboren immuunsysteem als het adaptieve immuunsysteem. Daarnaast hebben we de rol van NOD1 en NOD2 onderzocht in een muismodel voor invasieve aspergillose. We vonden dat muizen die deficiënt zijn in ofwel NOD1 dan wel NOD2 beschermd zijn tegen een dodelijke infectie met Aspergillus. NOD2 deficiënte muizen ontwikkelden echter nog ernstige symptomen van de ziekte. Aan de andere kant lieten de NOD1 deficiënte muizen weinig symptomen van de infectie zien en zij herstelden zich snel na de infectie. Door cellen van deze muizen in vitro te gebruiken hebben we aangetoond dat NOD1 deficiënte cellen efficiënter zijn in het opwekken van een cytokinerespons tegen Aspergillus dan cellen van wild-type of NOD2 deficiënte muizen. Daarnaast hebben we aangetoond dat macrofagen die NOD1 missen beter in staat zijn een oxidatieve burst te genereren, en daarbij beter in staat zijn om sporen van Aspergillus te doden. De resultaten in dit hoofdstuk tonen aan dat NOD1 een slechte invloed heeft op de afweer tegen Aspergillus, omdat deficiëntie van NOD1 geassocieerd wordt met bescherming tegen dodelijke Aspergillus infectie en een verhoogde capaciteit om een effectieve immuunrespons tegen de schimmel op te wekken. Om deze redenen wordt gesteld dat NOD1 mogelijk een toekomstig doelwit is voor nieuwe immunotherapie om de afweer tegen Aspergillus te verbeteren gedurende een periode waarin het immuunsysteem gecompromitteerd is.

De mate waarin verschillende immuuncellen met elkaar communiceren is essentieel voor het opwekken van een efficiënte immuunrespons. Een effectieve communicatie tussen het aangeboren afweersysteem en het adaptieve immuunsysteem door cytokines speelt een belangrijke rol in het polariseren van de adaptieve immuunrespons. Wanneer dit echter niet efficiënt gebeurt kan de adaptieve afweerreactie de aangeboren afweer niet versterken. De cytokine IL-1 speelt een prominente rol in de immuunrespons. Deze cytokine speelt een cruciale rol in het rekruteren van neutrofiele granulocyten, zowel direct, alsmede door indirect eerst T-helper responsen te induceren die vervolgens granulocyten rekrutering activeren 23,24. In hoofdstuk 7 focust de samenvatting van de literatuurstudie op de rol van de IL-1 cytokine familie in de afweer tegen A. fumigatus, en met name de klassieke leden van de IL-1 familie: IL-1ß en IL-1a. Ook wordt de potentie van de IL-1 pathway als een potentieel doelwit voor immunotherapie in aspergillose geëvalueerd. IL-1 is een zeer potente activator van de proinflammatoire immuun respons. Juist om deze reden zou het blokkeren van L-1 gebruikt kunnen worden om Aspergillus geassocieerde immunopathologie te voorkomen die beschreven is in de ziektebeelden ABPA, CPA en chronische granulomateuze ziekte (CGD). Echter het versterken van de IL-1 as zou op zijn beurt een potentiële therapie kunnen zijn voor immuungecompromitteerde patiënten, die een verbetering van schimmel klaring kan bewerkstelligen. In dit hoofdstuk is ook ingegaan op de wijze waarop polymorfismen in genen van de IL-1 pathway genetische markers zijn om gevoeligheid voor aspergillose te voorspellen en risicopatiënten te identificeren die baat kunnen hebben bij intensieve zorg en profylactische antimycotische therapie.
A. fumigatus gebruikt verschillende strategieën waardoor het voorkomt door het immuunsysteem herkend te worden. Rodlets en melanine zijn aanwezig op het oppervlak van de sporen en schermen PAMPs af die de immuunrespons kunnen activeren 1,25,26. Galactosaminogalactan (GAG), een molecuul in de celwand van A. fumigatus, kan zich voordoen als een virulentie factor 27. Deze suiker wordt uitgescheiden tijdens de groei van Aspergillus en remt het rekruteren van neutrofiele granulocyten, hetgeen ten gunste van de schimmel is 27. Het was onbekend hoe GAG deze immuun onderdrukkende effecten induceerde, daarom hebben we deze effecten in hoofdstuk 8 nader onderzocht. In dit hoofdstuk wordt bewezen dat GAG het menselijk immuunsysteem onderdrukt. Deze polysacharide is in staat om de Th17 respons in humane immuuncellen te remmen. De immunosuppressieve effecten van GAG zijn onderzocht en aangetoond is dat GAG IL-1 receptor antagonist (IL-1Ra) een potente anti-inflammatoire cytokine induceert. Daarnaast hebben we geconstateerd dat muizen die voor IL-1Ra deficiënt zijn beschermd tegen de immunosuppressieve effecten van GAG. Dit creëert mogelijkheden voor nieuwe behandelingen tegen acute invasieve aspergillose gericht op IL-1Ra. Ook hebben we geconstateerd dat therapie met GAG muizen beschermt tegen inflammatoire ziekten zoals colitis ulcerosa en allergische aspergillose. Deze observatie uit het onderzoek kan er toe leiden dat GAG, of een afgeleide structuur van GAG, gebruikt zou kunnen worden voor behandeling van IL-1 gedreven inflammatoire ziekten zoals colitis, gewricht- en spierziekten, diabetes en jicht.

Door de belangrijke rol van IL-1 in de afweer, en in het bijzonder de afweer tegen Aspergillus, is het aannemelijk dat genetische variaties die de activiteit van IL-1 beïnvloeden een rol spelen in de gevoeligheid voor aspergillose en het klinisch verloop van aspergillose. In hoofdstuk 9 beschrijven we dat veel voorkomende genetische variaties in IL1B en IL1RN (de genen voor IL-1ß en IL-1Ra) de cytokine respons tegen Aspergillus door afweercellen van gezonde vrijwilligers beïnvloeden. Ook is in een groep patiënten die orgaantransplantatie ondergingen deze genetische variaties, en een variatie in het DEFB1 gen dat codeert voor de potente antimicrobiele peptide ß-defensin, geassocieerd met een verhoogde gevoeligheid voor invasieve schimmelinfecties. Deze associatie benadrukt hoe belangrijk de IL-1 as en ß-defensin zijn in de afweer tegen schimmelinfecties bij patiënten met een orgaantransplantatie. De onderzochte genetische variaties kunnen in de toekomst gebruikt worden om risicoanalyses te maken. Hierdoor krijgen transplantatiepatiënten een gepersonaliseerde profylactische antimycotische therapie en worden zij intensiever diagnostisch gescreend.
De IL-1 cytokine familie bestaat niet alleen uit: IL-1a, IL-1ß, en IL-1Ra, maar ook uit andere leden zoals IL-18 dat de Th1 respons reguleert en uit IL-33 dat op zijn beurt de Th2 respons reguleert. Sommige IL-1 familieleden zijn door nieuwe inzichten in hun biologische functie28 recentelijk herbenoemd, namelijk: IL-36a (IL-1F6), IL-36ß (IL-1F8), IL-36? (IL-1F9) en IL-36Ra (IL-1F5). De IL-36 cytokines oefenen hun biologische functie uit door de IL-36 receptor te binden en te activeren, en krijgen de laatste tijd steeds meer aandacht vanwege hun rol in de pathogenese van psoriasis 29-31. In hoofdstuk 10 wordt een overzicht gegeven van de huidige kennis over de IL-36 cytokine familie, met een focus op de biologie van deze cytokines in verschillende ziektes. Dit overzichtsartikel beschrijft hoe de nieuwe IL-1 familieleden ontdekt zijn en beschrijft de biologische functies van deze cytokines. Ook is in dit hoofdstuk beschreven hoe de IL-36 agonisten en antagonisten geproduceerd worden, en hun algemene rol in het immuunsysteem. Tenslotte wordt op basis van de wetenschappelijke literatuur de rol van de IL-36 cyokines in een breed spectrum van inflammatoire ziektes beschreven en wordt gespeculeerd over de mogelijke toekomstperspectieven van IL-36 cytokines voor de medische wetenschap.

Naast het feit dat de IL-36 cytokines een belangrijke rol spelen in homeostase van de huid, zijn deze cytokines ook belangrijke signaalmoleculen voor het rekruteren van granulocyten naar de luchtwegen 32. De IL-36 receptor zit op het oppervlak van naïeve CD4 T-cellen en speelt een belangrijke rol in de activatie van deze cellen 33. Derhalve is in hoofdstuk 11 de rol van IL-36 in de afweer tegen Aspergillus onderzocht. We vonden dat Aspergillus mRNA expressie van de IL-36 cytokines en hun antagonist IL-36Ra kon induceren. Daarnaast vonden we dat de IL-36 cytokines de inductie van de Th1 en Th17 respons door Aspergillus reguleerden. Deze regulatie is vervolgens bevestigd door endogeen IL-36Ra met antilichamen weg te vangen wat resulteerde in een versterking van de Th1 en Th17 inductie door Aspergillus. Verder is in het onderzoek aangetoond dat de PRRs TLR4 en dectine-1 de inductie van IL-36? door Aspergillus reguleren. De bevinding dat een nieuwe cytokine familie de Th1 en Th17 inductie door Aspergillus reguleert, zorgt voor nieuwe mogelijke doelen voor de ontwikkeling van een immunotherapie voor aspergillose. De screening van genetische variaties in deze cytokines zou kunnen helpen om een verhoogde gevoeligheid voor aspergillose te voorspellen.
Door vaker voorkomende resistentie van A. fumigatus voor anti-mycotica is er een vraag naar alternatieve behandelingsstrategieën. Modulatie van de afweerreactie wordt geprezen als een veelbelovende therapie die in combinatie met de standaardtherapie de mortaliteit van invasieve schimmelinfecties kan terugbrengen. In hoofdstuk 12 worden casussen beschreven van patiënten met invasieve candidiasis. De patiënten zijn geïncludeerd in een klinische trial en ontvingen naast de standaard zorg additionele immunotherapie behandeld met recombinant IFNy. Ook zijn verschillende patiënten beschreven met invasieve schimmelinfecties die als laatste redmiddel immunotherapie met IFNy kregen. De resultaten van dit onderzoek geven een eerste bewijs dat immunotherapie met IFNy de capaciteit van immuuncellen om pro-inflammatoire cytokines te produceren kan versterken. Deze data ondersteunen de gedachte dat patiënten met ernstige invasieve schimmelinfecties baat zouden hebben bij immunotherapie met IFNy. Daarnaast vormen ze de basis voor het ontwikkelen van nieuwe studies met grotere groepen patiënten om klinische toepassing van immunotherapie (met INFy) in invasieve schimmelinfecties diepgaand te onderzoeken.

Voortgekomen uit onderzoek 8.1.15.024